Спосіб прискореного отримання результату аналізу препаратів метафазних хромосом лімфоцитів периферійної та пуповинної крові

Резюме. Наведено вдосконалену методику культивування і приготування препаратів метафазних хромосом лейкоцитів периферійної та пуповинної крові людини. Ця методика дає змогу отримати результат цитогенетичного дослідження з каріограмою протягом 56 годин, а також раніше провести медико-генетичне консультування і надати спеціалізовану медичну допомогу.
Ключові слова: препарати, метафазні хромосоми, лімфоцити, периферійна та пуповинна кров.

Вступ

Народження дитини з вадами розвитку або хромосомною патологією залишається серйозною соціально-економічною проблемою як для окремої родини, так і для суспільства в цілому. Виявлення хромосомних аномалій у немовлят з вадами розвитку в найкоротший термін після народження є однією з основних проблем консультування родин генетиком, хірургом та іншими спеціалістами. Не менш важливим, а з точки зору отримання матеріалу для дослідження – складнішим, є встановлення каріотипу пренатально при ознаках хромосомної патології у плода. Інколи для встановлення чи характеристики порушення у новонародженого або плода необхідно дослідити каріотипи батьків та застосувати додаткові цитогенетичні методи. Визначення нормального каріотипу чи певної хромосомної патології допомагає вирішити питання щодо надання спеціалізованої допомоги та спрогнозувати ускладнення.

Аналіз хромосомного набору з різних тканин проводять понад півстоліття. Сьогодні найуживанішим для класичного хромосомного аналізу є культивуван¬ня лімфоцитів людини з подальшою обробкою та фіксацією (напівмікрометод), яка була запропонова¬на в 1965 p. Hungerford [5], а також у різних модифікаціях [1, 2]. Однак приготування препаратів за існуючими методиками не дає змоги отримати якісну каріограму менше ніж за тиждень у зв’язку з особливостями фарбування та аналізу «свіжих» препаратів.

Мета роботи – вдосконалення загальноприйнятої методики культивування, фіксації та приготування препаратів метафазних хромосом лейкоцитів периферійної та пуповинної крові з використанням диференційного G-фарбування для отримання достовірного результату (каріограми) в найкоротший термін.

Матеріал і методи дослідження
Для дослідження використовувалось 10 зразків крові: 7 зразків периферійної та 3 – пуповинної крові (отриманої шляхом кордоцентезу на 20-21-му тижні вагітності), яку перевірено на предмет контамінації материнською кров’ю [3]. Периферійна кров використовувалась при підозрі на хромосомну патологію новонароджених (6 зразків) та в одному випадку – у батька пацієнта з підозрою на незбалансовану транслокацію між хромосомами Y та 22, пуповинна – для підтвердження хромосомної патології, встановленої в результаті каріотипування плода (біоптат плаценти). Культивування крові проводили за загальноприйнятою методикою Hungerford [5] та за власною модифікацією. Для культивування використовували комерційну суміш Pb-max (Gibco), яка містить фітогемагглютинін (ФГА), причому до 4 мл суміші Pb-max додавали 0,3-0,5 мл гепаринізованої крові залежно від якості зразка. Препарати підлягали G-фарбуванню та аналізу за допомогою комп’ютерної програми «Видеотест Карио-3.1», в результаті якого записувалась каріограма і видавався висновок.

Результати досліджень та їх обговорення
Відомо, що внаслідок стимуляції ФГА 90% лімфоцитів поділяються один раз, 65% – двічі і близько 40% – тричі. При цьому перший мітоз проходить приблизно через 50 годин після початку стимуляції мітогеном.

Класична методика та її модифікації передбачають культивування лімфоцитів протягом 69-72 годин. В нашому дослідженні час культивування зменшено до 50 годин, після чого до культури додавали 0,1 мл розчину колхіцину в концентрації 10 мгл/мл і культивували ще 2 години для збільшення кількості клітин, які перебувають на стадії метафази.

Гіпотонічну обробку і фіксацію культури метанол-оцтовим фіксатором проводили за стандартною методикою з інтервалами між змінами фіксатора 30 хвилин. На кінцевому етапі суспензію краплями наносили на охолоджені знежирені предметні скельця «Superfrost» в теплому приміщенні. Для висихання препарати поміщали в термостат 37°С на 20-30 хвилин, після чого миттєво наносили 0,25% розчин трипсину та одразу фарбу «Giemza» в стандартній концентрації на 5 хвилин. Надлишок фарби змивали проточною водою кімнатної температури та висушували на повітрі протягом 10 хвилин. Препарати аналізували на збільшенні х1000 з використанням мікроскопа Axioskop 40 (Zeiss) та комп’ютерної програми «Видеотест Карио-3.1».

Отримані результати показали, що при використанні прискореного культивування (50 годин) мітотичний індекс дещо знижений, якщо порівнювати з 72-годинною культурою, але кількість метафазних пластинок на склі дає змогу якісно проаналізувати хромосомний набір і виключити мозаїцизм.

Таким чином, за допомогою модифікованої методики встановлено 6 нормальних каріотипів, три випадки трисомії 21 хромосоми і реципрокну транслокацію між хромосомами Y та 22 у короткий термін (56 годин). При порівнянні результатів каріотипу для паралельних культур отримано однакові результати для кожного випадку. Записано каріограми з диференційно-зафарбованими хромосомами.

Висновки

Вдосконалена методика культивування і приготування препаратів метафазних хромосом лейкоцитів периферійної та пуповинної крові людини дає змогу отримати результат цитогенетичного дослідження з каріограмою протягом 56 годин. Прискорене отримання каріотипу дозволяє раніше провести медико-генетичне консультування і надати спеціалізовану медичну допомогу.